基因多态性在冠心病研究中的应用

众多研究表明，冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是一种 多基因遗传病。长期以来，临床上发现同样是动脉粥样硬化(AS)患者发生心、脑血管合并症的机会悬殊很大，而且在对调脂药物的治疗反应上，个体之间也存在很大差异。研究发现，这些现象与多基因变异影响血脂代谢、血栓形成及血管收缩与舒张等病理生理过程有关。各种载脂蛋白(Apo)、脂蛋白受体和脂质转运蛋白和酶基因多态性(gene polymorphism)为研究冠心病的发生、发展及临床诊治开辟了一个新的领域。

一、基因多态性

多态性(polymorphism)是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或 基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(genetic polymorphism)或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生源于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。冠心病这类多基因遗传病是多个遗传因素影响不同的易感基因或/ 和同一易感基因的一个以上相关位点以及与后天环境因素共同作用的结果，在正常人群中亦存在这些基因变异。

患病群体和非患病群体间只是 基因频率(gene frequency)上的差异。基因多态性不仅可用于经典的遗传分析(遗传病的基因诊断和连锁分析)，还可用于疾病的关联分析、疾病相关基因的定位、法医学的个体识别与亲权鉴定、疾病发生的分子遗传机理的阐明、环境因素易感基因的检出以及药物基因组学中指导用药和药物设计等。

人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异。通常分为3大类：

⑴限制性片段长度多态性(RFLP)，即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。这是一类比较普遍的多态性。

⑵DNA重复序列的多态性，特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，并主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星(minisatallite)DNA由15~65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列(VNTR)决定了小卫星DNA长度的多态性，如apoB基因3"端高变区(HVR)由长15bp富含A-T的不同拷贝数的串联重复序列组成。微卫星(microsatallite)DNA的基本序列只有1~8bp，而且通常只重复10~60次。如apo(a)基因存在着由(TTTTA)n组成的重复序列。

⑶单核苷酸多态性(SNP)，即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，这是目前倍受关注的一类多态性。SNP通常是一种双等位基因的(biallelic)，或二态的变异。作为一种碱基的替换，SNP大多数为转换，特别在CG序列上出现最为频繁。据估计，单碱基变异的发生频率在1‰~2‰。如假定1/1000的碱基是多态的话，人类30亿碱基中当有约三百万个SNP位点，它们绝大多数位于非编码区。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。

二、 基因多态性的研究方法

理想的基因多态性研究方法应该具有灵敏度高、简便、快速、准确且经济实用等优点。RFLP的检测多用Southern印迹杂交法或用限制性内切酶识别消化结合电泳的方法。但由于所检测突变范围窄，可进一步结合聚合酶链反应(PCR)扩大RFLP的使用范围(即用PCR-RFLP法)。通常应根据基因变异的类型采用不同的分析方法，如基因缺失可用基因探针杂交，PCR扩增直接检测。点突变可用单链构象多态性(SSCP)、放大受阻突变系统(ARMS)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交、扩增片段长度多态性(AFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、ASO引物PCR、DNA测序等直接检查。

小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性多通过PCR直接扩增其所在区域，然后用电泳分析测定。也可以直接测序来判断小卫星DNA和微卫星DNA重复单位的拷贝数。原则上任何用于检测上述2类多态性标记的技术都可用于SNP的识别或检出。例如RFLP法、ASO探针杂交、寡核苷酸连接测定(OLA)、ARMS、DNA测序等。近年来又相继报道一些新的基因多态性研究方法，如变性高效液相色谱(DHPLC)技术、荧光定量PCR技术(TaqMan PCR)、侵入检测技术(invader assay)、Snapshot、分子灯塔技术(molecular beacon)、 基因芯片(DNA芯片)等。

以apoE基因多态性为例，目前应用较多的主要有3种研究方法：

⑴ASO引物PCR法：设计5种引物D、E、F、G和H，可编码apoE基因第4外显子区299个氨基酸的基因序列。其中引物H为公共引物，分别与引物D、E、F和G配对扩增，在同一个反应管内进行PCR反应。确认一份样品的基因型需进行4次反应，引物D决定112位精氨酸(Arg)，引物E决定112位半胱氨酸(Cys)，引物F决定158位Arg，引物G决定158位Cys。

⑵PCR-RFLP：设计一对引物特异性扩增apoE基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列，扩增产物经HhaI酶切后电泳染色分析，即可检测出6种apoE基因型。

⑶双反应体系ARMS快速分型法：设计5条引物, P1和P2分别检测158位Cys和Arg;P3和P4分别检测112位Cys和Arg;P5为公共引物。分别组成两个体系，A体系和B体系，其中A体系中加入了P1, P3;B 体系中加入了P2, P4。根据扩增反应结果即可判定基因型。目前最常用的方法为后两种。

三、 基因多态性与冠心病

基因多态性在冠心病中的应用研究主要涵盖下列3个方面的内容：

⑴与冠心病易感性的联系。如载脂蛋白基因多态性与AS、冠心病的关系等。

⑵与临床表型及预后的联系。如冠心病等多基因疾病的临床表型往往多样化，阐明基因型与 表型(phenotype)之间的联系对于认识疾病的发生机理、预测疾病的转归等方面有重要的作用。

⑶与冠心病治疗效果的联系。载脂蛋白基因多态性与冠心病关系研究一直是临床研究的热点，其中主要关注的是apoB、apoE和apo(a)。

apoB基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有75处，其中导致氨基酸改变的有54处。一方面，apoB基因变异可导致短apoB的合成，apoB水平降低，进而产生低胆固醇血症，并与冠心病的发生危险减少有关。

另一方面，如apoB基因第26外显子上第10708位碱基G→A，使第3500位的Arg被置换为谷氨酰胺(Gln)，突变导致低密度脂蛋白(LDL)与LDL受体(LDLR)的结合能力下降，产生高胆固醇血症[家族性apoB缺陷(FDB)];ApoB基因Arg3531Cys突变，使第3531位的氨基酸由Arg变为Cys，也可以导致LDL对LDLR 亲和力的下降，血浆总胆固醇(TC)水平的升高。此外，apoB基因是XbaⅠ、EcoRⅠ、MspⅠ酶切位点多态性、3"VNTR多态性、启动子区-516C/T多态性以及5"端信号肽(SP)插入/缺失(I/D)多态性与血脂异常及冠心病的发生有关。

apoE基因多态性影响血脂代谢，与冠心病关系密切。早期观察到apoE2/2表型的III型高脂蛋白血症患者在未成年即患冠心病。许多研究发现，e4等位基因可以显著地升高健康人的TC浓度，使之易患AS。相反，e2可降低TC浓度，其降低效应是e4升高TC的2~3倍。apoE基因变异还与血浆apoB浓度、TG及血管收缩压有关。临床研究发现，患心血管疾病如冠心病、心肌梗死(MI)幸存者，或血管造影证明有AS者，比其对照组的e4等位基因频率高。

e4/3杂合子比e2/3和e3/3基因型者发生MI年龄早。此外，apoE基因多态性还与肾病综合征、糖尿病，特别是与老年性痴呆(Alzheimer病)之间有很强的关联性。

apo(a)基因多态性是由apo(a)基因中Kringle4的数目的变化而引起的，与Lp(a) 水平有关，数目不等的Kringle4等位基因可解释90%以上Lp(a)的变异。Kringle4基因片段含有几个稀少的限制性酶切位点(NotI、SfiI、KspI、SvaI、KpnI), 可用于apo(a)多态性的筛选。可以采用KpnI限制性片段(含编码Kringle4的序列)作为探针进行杂交分析。除Kringle4拷贝数影响Lp(a)水平外，还存在大量影响Lp(a)水平的apo(a)基因多态性，如在距apo(a)基因第1外显子5"端1.5Kb区域内存在的微卫星多态性与血浆Lp(a)水平及冠心病相关联。

许多研究还发现，apoAI-CⅢ-AIV 基因簇多态性、LDLR基因多态性(如5"端大于10Kb片段突变)、脂蛋白脂酶(LPL)基因PvuⅡ、HindⅢ位点多态性、CETP 基因常见多态性(TaqIB、D442G、14内含子G→A)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性、纤溶酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)基因启动子4G/5G多态性、血栓调节素(TM)基因启动子G-33A多态性、血小板糖蛋白Ⅲa基因PIA1/PIA2多态性、肾素-血管紧张素系统(RAS)基因多态性[如血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态性、血管紧张素原(AGT)基因M235T、T174M多态性、血管紧张素ⅡⅠ型受体(AG2R/AT1R)A1166C多态性]、屏氧酶(PON)1基因Q/R多态性、内皮型一氧化氮(eNOS)基因错义多态性等与冠心病有关。此外，研究显示，CETP基因TaqIB多态性对冠心病患者使用普伐他汀(pravastatin)治疗效应有影响。LDLR基因AvaⅡ、PvuⅡ多态性，apoB基因I/D多态性与巴西高胆固醇血症、冠心病患者用氟伐他汀(fluvastatin)进行调脂治疗的反应性不同有关。

四、 存在的问题与解决方法

目前，国内外不少研究者对同一种疾病(如冠心病)及同一种候选基因(如apoB)进行的基因多态性分析，尽管所用的方法学基本相同，但结论可能完全不一样。造成这种现象的主要原因有：

⑴样品数量太少;

⑵样品的不均一性，如性别、种族等不同;

⑶选择标准及统计学处理方法不同，等等。

除此以外，更多的是由于未能认识疾病多样表型的重要意义。

许多基因多态性研究往往局限于基因多态性与冠心病发生的相关性。泛泛地进行频率调查或是简单地了解基因多态性与冠心病预后、转归的联系，忽视了基因多态性与冠心病临床表型多样性的内在联系。没有把研究重点放在为什么不同的个体冠心病的表现不一样以及为什么不同的个体对相应的治疗药物会有不同的反应等深层次的原因上，不触及临床问题的实质